A terapia gênica é uma estratégia terapêutica incrivelmente versátil que pode ser usada para tratar doenças monogênicas. A terapia gênica pode inativar ou silenciar transcrição de genes mutantes, editar o genoma para reparar genes mutantes ou expressar cópias saudáveis de genes de doenças. A terapia gênica geralmente é realizada usando um vetor viral, mas isso pode levar a vários problemas, como falta de controle sobre os níveis de expressão, alterações no DNA ou RNA diferentes dos efeitos desejados e vetores virais se tornando parte do DNA humano. Esses efeitos adversos poderiam ser minimizados se a expressão da terapia gênica pudesse ser rigorosamente controlada. Foi isso que a equipe liderada pelo Dr. Davidson se propôs a fazer: eles desenvolveram um interruptor para controlar se a terapia gênica está ativa ou se está desligada.

O grupo iniciou sua busca por um interruptor para terapia gênica identificando pequenas moléculas capazes de alterar o splicing. O splicing é o processo no qual um transcrito de RNA mensageiro recém-sintetizado é convertido em um RNA mensageiro maduro. Durante o splicing, as porções do código genético no RNA mensageiro recém-criado, chamadas de íntrons, são removidas entre as seções chamadas de éxons. Ao unir os éxons novamente, um mRNA maduro é produzido (mRNA). No tratamento da Atrofia Muscular Espinhal (AME) – uma doença do neurônio motor com início na infância – existem pequenas moléculas regulamentadas que agem ligando-se a uma posição onde um transcrito de mRNA recém-sintetizado normalmente seria unido para gerar o transcrito maduro. O grupo aproveitou esse sistema para controlar a inclusão ou exclusão de material genético que sinaliza se uma proteína deve ou não ser produzida a partir do RNA transcrito. Se nenhuma proteína for produzida, então a terapia gênica não seria expressa e estaria em um estado desligado, se uma proteína for produzida, então a terapia gênica estaria ativa ou ligada.

Primeiro, os pesquisadores precisavam encontrar um “contexto” genético que respondesse à pequena molécula interruptora de splicing, quando usada em uma dose baixa. Depois de tratar as células com o composto chamado LMI070, o grupo procurou mudanças nos padrões de splicing em comparação com células não tratadas. O grupo encontrou 45 eventos alterados no splicing de controles versus células tratadas com LMI070. Esses eventos incluíram uma mudança de splicing no gene SF3B3. Ao reanalisar os dados publicados de sequenciamento de RNA, eles descobriram que muitos desses eventos, incluindo o SF3BS, foram consistentemente alterados. Em seguida, o grupo analisou a frequência com que essas alterações de splicing ocorreram sem o tratamento com LIM070. Ao analisar esses 45 eventos em 21.504 conjuntos de dados humanos de RNA-seq, a equipe descobriu que a mudança induzida por LMI070 em SF3B3 raramente ocorre naturalmente (sem a presença de LMI070). Finalmente, o grupo descobriu que o tratamento com LMI070, na dose que leva a mudanças robustas no splicing SF3B3, causou mudanças mínimas na expressão gênica. Apenas cinco genes upregulated e nove downregulated foram identificados. Este trabalho mostrou que o evento de splicing SF3B3 é um “contexto” genético altamente seletivo, responsivo a baixas doses de LMI070 e que o tratamento com LMI070 causou efeitos fora do alvo mínimos – uma característica muito procurada para trocas de terapia gênica.

Para obter o controle da terapia gênica, o grupo criou um éxon sintético que contém o sinal de onde começar a produzir uma proteína. Eles inseriram este éxon sintético dentro do contexto genético de SF3B3 que responde a LMI070. Essa sequência genética combinada foi chamada de X^on. Nesse sistema, o tratamento com LMI070 levou à inclusão do éxon sintético no mRNA maduro e à produção de um repórter, a proteína fluorescente verde (GFP). O repórter GFP permite que os pesquisadores rastreiem o nível de controle que eles têm sobre o sistema. Sem LMI070, não há produção de GFP.